实验方案｜鼠源IgM型抗PEG抗体双抗体夹心ELISA检测

本文内容整理自 anti-PEG 官方技术资料，仅用于科研交流，不可用于人体或临床治疗。

上一篇【说明书速查丨IgM型抗PEG抗体】中提及的三株抗体：AGP3、AGP4、rAGP6，可作为捕获抗体用于做双抗体夹心 ELISA：包被捕获抗体抓取样本里的PEG链，再用生物素标记抗PEG抗体结合PEG另一表位，链霉亲和素-辣根过氧化物酶显色，OD405换算PEG化分子浓度。

一、实验材料

a. 捕获抗体 + 生物素标记抗体 （见下表） 

b.酶联免疫板

c.包被缓冲液：每升含5.3g碳酸钠+ 4.2g碳酸氢钠，pH 8.0，用12 mol/L盐酸调节pH

d.PBS缓冲液：0.14 mol/L氯化钠，2.7 mmol/L KCL，1.5 mmol/L磷酸二氢钾，8.1mmol/L 磷酸氢二钠，pH 7.4 

e.封闭液：PBS配制5% 脱脂奶粉

f.样本稀释液：PBS配制2% 脱脂奶粉

g.洗涤缓冲液：PBS和 PBS-T（加入0.05% Tween-20的PBS）

【rAGP6-6.3-biotin方案，用PBS-C（加入0.05% CHAPS的PBS）】

h.链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP） 

I.HRP显色底物：50 mg/100 mL ABTS，溶于100 mmol/L柠檬酸-磷酸缓冲液（pH 4.0，每升超纯水加入17.4 g磷酸氢二钾、21g柠檬酸）。临使用前，每10 mL ABTS底物溶液需加入3μL 30%过氧化氢。

【rAGP6-6.3-biotin方案用2μL 30% 过氧化氢】

表1 anti-PEG™的捕获抗体+生物素标记抗体

二、操作步骤

 表2 操作流程表

三、注意事项

1.ABTS底物必须现配现用，过氧化氢要临显色前添加；

2.SA-HRP孵育结束后洗涤多次目的是降低非特异性背景；

3.6.3-biotin对Tween-20高度敏感，会抑制结合活性，须用CHAPS4；

4.预混完成需尽快加到孔内，避免液相中生物素抗体-SA-HRP复合物聚集沉降，造成信号异常、孔内斑点。

四、实验方法选择参考

五、结语

按文中所提操作执行，包被、洗板、孵育、显色四步串联可获得稳定的 PEG 化分子定量结果；常规场景建议走两步孵育法，初筛场景用预混一步法提效。

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